图 单细胞拉曼技术评估土壤表型耐药性并靶向分选和测序高活性耐药菌

在国家自然科学基金项目(批准号：21922608、22176186、42021005)等资助下，中国科学院城市环境研究所朱永官、崔丽研究团队在土壤原位活性抗生素耐药菌示踪和耐药性传播研究方面取得新进展。研究成果以“单细胞拉曼结合靶向宏基因揭示土壤抗生素耐药组(Active antibiotic resistome in soils unraveled by single-cell isotope probing and targeted metagenomics)”为题，于2022年9月26日发表在《美国科学院院刊》(Proceedings of the National Academy of Sciences)上。

抗生素耐药性(AMR)在人类、环境和动植物间的传播大大加剧了全球“One Health”负担。土壤中栖息着地球上最为丰富多样的微生物，其中活性耐药菌在驱动土壤耐药性传播中起着关键作用。由于高达99%的土壤微生物不可培养，针对土壤原位活性耐药菌的研究很少，从而使土壤中抗生素耐药性的研究面临巨大挑战，阻碍了对AMR环境行为及阻控策略的发展。虽然分子生物学技术提升了我们对土壤微生物组和抗性组的认识，但基因信息仅反映耐药潜力而非耐药表型，且不能区分胞外、死亡或休眠菌的DNA，仍然难以剖析具体发挥作用的耐药微生物，影响了AMR健康风险的精确评估。因此，亟需开发合适的技术手段，从表型和基因型两个层面全面解析土壤中重要的活性耐药菌。

该研究团队利用单细胞拉曼-重水同位素标记技术，针对土壤的复杂性以及对抗生素有效性的影响，通过优化抗生素剂量、孵育时间、采谱深度，建立了准确示踪土壤活性耐药菌的单细胞方法及判别标准，并利用土壤原位环境的多种已知抗性菌和敏感菌，对方法在不同土壤和不同机制抗生素的普适性和准确性，进行了交互验证，成功将该方法从简单的临床耐药菌的研究拓展至包含大量未培养菌的复杂土壤环境，进而在单细胞水平和表型层面，揭示了人类活动(如农业耕种和污染排放)显著增加土壤的表型耐药水平。针对拉曼技术识别的具有潜在健康风险的高度活跃土壤耐药菌，利用单细胞分选与靶向宏基因组测序技术，鉴定出多数高表型耐药菌属于之前难以研究的未培养菌，以及一株新型的抗生素抗性病原菌，证明了土壤未培养菌是AMR的重要宿主。

该工作将多种抗生素耐药表型和多种基因型关联，为解析环境中大量未培养耐药菌提供了崭新的方法，对在“One Health”框架下推进环境耐药性的风险评估与制定防控策略，具有重要价值。