用18F代替68Ga标记得到的18F-exendin-4性能如何？
已有研究显示68Ga-exendin-4可与胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)发生特异性结合，对胰岛素瘤具有诊断价值。对比68Ga，18F具有产量高、能量低、半衰期适宜等优点，基于此，谢运飞等开展了18F-exendin-4的自动化合成研究，并报告了1例临床病例应用结果。研究结果显示合成的药物达标、安全可靠，胰岛素瘤患者胰腺体部见结节状18F-exendin-4高摄取。
研究背景
胰岛素瘤是胰腺最常见的功能性神经内分泌肿瘤(neuroendocrine neoplasm, NEN)，大多为良性[1]。高胰岛素血症性低血糖是其主要的临床症状，同时伴随震颤、心悸等自主神经症状，及精神错乱、行为改变、人格改变、视觉障碍、癫痫发作和昏迷等意识障碍及精神症状[2]。目前，胰岛素瘤的病因和发病机制尚不十分清楚。
胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1, GLP-1)受体(GLP-1 receptor， GLP-1R)在胰岛素瘤中存在过表达，因此针对GLP-1R的靶向成像成为胰岛素瘤分子影像诊断的研究热点[3]。Exendin-4为GLP-1R激动剂的类似物，研究显示68Ga标记exendin-4可与GLP-1R发生特异性结合，用于胰岛素瘤特异性诊断[4]。相较于68Ga，18F具有产量高、能量低、半衰期适宜等优点，笔者推测18F标记的exendin-4可能具有良好的应用前景，更适用于已配备医用回旋加速器的医疗机构使用。目前，18F标记exendin-4多为动物体内研究，鲜见临床应用报告[5]。本研究拟采用自动化合成模块探索18F-AlF-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid, NOTA)-马来酰亚胺(maleimide, Mal)-半胱氨酸(cysteine, Cys)39-exendin-4(简称18F-exendin-4)的放射性标记，并完成体内显像验证，为18F-exendin-4 PET/CT在胰岛素瘤诊断中的临床推广和应用奠定基础。
材料与方法
1.仪器设备。 MINItrace医用回旋加速器(美国GE公司);All in one多功能化学合成器(比利时Trasis公司);高效液相色谱(high performance liquid chromatography， HPLC)仪(美国Agilent公司)，TC-C18 250 mm×4.6 mm HPLC柱(美国Agilent公司)，HPLC-6111放射性检测器(美国Eckert & Ziegler公司);Biography mCT Flow 64 PET/CT仪(德国Siemens公司);CRC-55tR放射性活度计(美国Mirion公司);Endosafe PTS内毒素快速检测仪(美国Charles River公司);ESJ120-4电子天平(沈阳龙腾电子有限公司);PHSJ-3F实验室pH计(上海仪电科学仪器有限公司);移液枪(美国Thermo Fisher公司)。
2.试剂和材料。 HPLC级乙腈、AlCl3、乙酸钠(成都市科龙化工试剂厂);二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)、冰乙酸(上海麦克林生化科技股份有限公司);三氟乙酸(上海玻尔化学试剂有限公司);抗坏血酸钠(上海九鼎化学科技有限公司);生理盐水(四川美大康佳乐药业有限公司);灭菌注射用水(四川科伦药业股份有限公司);重氧水H218O(丰度为98%，上海化工研究院);胎牛血清(美国Gibco公司);前体NOTA-Mal-Cys39-exendin-4(江西探真生物技术有限公司，纯度：99.64%);Plus Light QMA、Plus Light HLB固相萃取柱(美国Waters公司);合成卡套及管路(比利时Trasis公司);PTS内毒素快速检测卡片(美国Charles River公司);0.22 μm无菌滤膜(美国Merck Millipore公司);西林瓶(江苏华益科技有限公司);精密pH试纸(上海三爱思试剂有限公司)。
3. 18F-exendin-4的自动化合成。 (1) 18F-收集干燥。医用回旋加速器生产18F-并传输至All in one多功能合成模块收集管，18F-经QMA柱捕获后，负压抽取0.5 ml 生理盐水通过QMA柱将18F-淋洗至反应管。负压抽取0.5 ml乙腈至反应管，120 ℃加热共沸2 min，再100 ℃加热1 min，得干燥18F-。(2)放射性标记。反应管温度降至70 ℃，负压抽取前体瓶中的前体溶液(NOTA-Mal-Cys39-exendin-4 500μg溶于50 μl水、2 μl 20 mmol/L AlCl3溶液、400 μl 0.5 mol/L pH值4冰乙酸/乙酸钠缓冲液、550 μl DMSO)至反应管，100 ℃加热密封反应20 min，反应完成后降温至70 ℃待转出。(3)纯化及制剂化。预留30 ml水(含100 mg 抗坏血酸钠)，注射器先抽取其中10 ml水至反应瓶稀释反应液，转出至HLB柱纯化，再抽取瓶内10 ml水冲洗HLB柱，重复2次。然后抽取2 ml 体积分数50%乙醇溶液淋洗HLB柱获得产品，并通过9 ml含75 mg 抗坏血酸钠的灭菌注射用水，将产品中乙醇稀释至
10%以下。产品溶液过0.22μm无菌滤膜，装入西林瓶待用。合成路线见图1。
4. 18F-exendin-4的质量控制。 (1)性状。透过铅窗观察注射液颜色及澄明度。(2) pH值测定。取微量注射液滴至精密pH试纸测注射液pH值。(3)放射性半衰期测定。按药典通则1401的方法进行[6]。(4)放化纯检测。色谱分离的流动相为溶剂A(含体积分数0.1%三氟乙酸的水)和溶剂B(含体积分数0.1%三氟乙酸的乙腈)。洗脱梯度：0～2min，10%B;2.01～15 min，10%～90%B;15.01～17 min，90%B;17.01～18 min，90%～10%B。流速为1.0 ml/min，柱温为25 ℃，进样量为10 μl，紫外检测波长为220 nm。(5)稳定性检测。取370 MBq 18F-exendin-4分别加入生理盐水及胎牛血清，37 ℃温育，于0、1、2、4 h通过HPLC检测稳定性。(6)细菌及内毒素检测。按药典通则1101方法进行无菌检测[5]。按内毒素检测卡片说明书进行内毒素检测。
5. 18F-exendin-4 PET/CT 显像。 患者女，55岁，5年前出现晨起后低血糖发作伴意识障碍，持续约10 min，排除癫痫相关疾病。CT、超声等未见明显异常，MRI结果显示，胰腺体部见一稍长T1稍长T2信号结节影，长径约15 mm，考虑胰岛素瘤。患者晨起进食后于本科签署知情同意书并行18F-exendin-4 PET/CT显像。显像时，患者全程持续滴注质量分数10%葡萄糖注射液，并分别于注射前、注射后20 min以及注射后50 min监测指尖血糖。按体质量4.44 MBq/kg的剂量进行18F-exendin-4静脉注射后，患者平躺休息，于注射后30 min及60 min进行图像采集，采集范围分别为腹盆部及全身(至股骨下缘)。使用Flow模式进行全身采集。CT采集参数：管电压120 kV，管电流自动mA，层厚3.0 mm，层间距2.0 mm，螺距0.8 mm。图像重建方法为TrueX+飞行时间，经计算机2次迭代、每次迭代21个子集重建，矩阵大小256×256。通过德国Siemens syngo VH210，TrueD工作站进行图像融合和SUVmax测定。该项目经四川省医学科学院·四川省人民医院伦理委员会审查并批准(批准号：2023年第375号)。
6.统计学分析。 数据采用IBM SPSS 22.0软件进行分析，符合正态分布的定量资料以x±s表示。
结 果
1. 18F-exendin-4自动化合成。 回旋加速器生产的18F-分别为2.67×104MBq、2.82×104 MBq、2.96×104 MBq，利用All in one多功能化学合成器完成自动化合成(n=3)，分别得到4.92×103MBq、4.29×103 MBq、5.44×103 MBq 18F-exendin-4。标记耗时约40 min，计算未衰减校正的产率为(18.03±2.67)%。比活度>39.74 GBq/μmol，放射性浓度分别为447.27、390.00、494.55 MBq/ml。
2. 18F-exendin-4质量控制。 注射液为无色透明液体，无肉眼可见悬浮物。pH值为6.5，放射性半衰期为109 min。HPLC示9.8 min附近可见一紫外吸收峰，10.3 min附近可见一放射性峰，测得产品放化纯分别为96.82%、97.08%、96.47%。稳定性结果显示，4 h后18F-exendin-4在生理盐水及胎牛血清中的放化纯依然>95%。细菌培养结果显示，产品为无菌;内毒素检测结果显示，每1 ml产品内毒素<15内毒素单位(endotoxin unit, EU)。
3. 18F-exendin-4 PET/CT显像。 患者注射前、注射后20 min以及注射后50 min的指尖血糖分别为4.94、4.43和4.02 mmol/L。注射后30 min行PET/CT腹盆部显像，结果显示胰腺体部见结节状18F-exendin-4高摄取，大小约13 mm×15 mm，SUVmax约5.9。注射后60 min的全身显像结果显示，18F-exendin-4高摄取病灶的位置及大小与30 min显像相同，SUVmax约7.5。PET/CT显像图如图2所示。查询医院病例系统中该患者的术后病理结果，显示胰腺包块为肿瘤性病变;肿瘤细胞免疫组织化学结果显示，人角蛋白抗原决定簇5.5(+)、CD10(+)、CD56(+)、CD99(+)、嗜铬粒蛋白A(+)、细胞角蛋白(核旁点状+)、G1/S-特异性周期蛋白D1(部分+)、上皮膜抗原(-)、胰岛素瘤相关蛋白1(+)、细胞增殖核抗原Ki-67(约4%+)、孕激素受体(+)、突触素(+)、波形蛋白(-)、β-连环蛋白(包膜+、胞质+)，符合NEN(G2)特征。
讨 论
胰岛素瘤诊断的影像学技术有：腹部超声、超声内镜、CT、MRI等，但在实际临床应用中均有不足之处。而核医学分子影像能够准确反映病理生理过程中机体发生的功能及生物学变化，是胰岛素瘤靶向诊断的又一利器。传统的NEN显像剂，如奥曲肽类似物，对生长抑素受体(somatostatin receptor, SSTR)2具有较高的亲和力，对SSTR3、SSTR4和SSTR5具有不同程度的亲和力[7]。但多数胰岛素瘤不表达SSTR2或SSTR5，因此使用奥曲肽类似物进行胰岛素瘤诊断的结果可能为假阴性[8]。6-18F-氟-L-多巴(6-18F-fluoro-L-dopa,18F-DOPA)可反映胰岛细胞内芳香族L-氨基酸脱羧酶的活性，其代谢程度与胰岛β细胞合成分泌胰岛素的能力呈正相关。但由于18F-DOPA在胰腺本底水平高，不易区分正常与病灶组织，且显像灵敏度报道不一，目前仅作为胰岛素瘤的二线诊断方法[9]。基于GLP-1R的68Ga-exendin-4 PET/CT显像对胰岛素瘤具有较强的诊断效能，已获广泛的临床认可[10]。由于18F在半衰期、产量、能量方面较68Ga更具优势，因此探索一种简便、高效的18F-exendin-4自动化合成方法并用于临床实践，对今后其在胰岛素瘤诊断中的临床推广具有重要意义。
本研究选择NOTA-Mal的双键与Cys39-exendin-4的巯基进行加成反应，得到NOTA-Mal-Cys39-exendin-4，作为标记前体[11]，并通过Al18F一步法标记，得到18F-exendin-4。利用All in one多功能化学合成器自动化合成18F-exendin-4，相较于N-2-(4-18F-氟苯甲酰氨基)乙基马来酰亚胺[N-(2-(4-18F-fluorobenzamido)ethyl)maleimide,18F-FBEM]-Cys39-exendin-4的合成[12]，不需要半制备HPLC纯化，非衰减校正的平均产率达18.03%，放射性标记耗时约40 min，且产品放化纯>96%，具有更强的可控性和实用性。对于产品的性状、pH值、细菌、内毒素等指标，检测后均符合《中华人民共和国药典(2020年版)》标准。为避免乙醇对血管内壁的刺激性，本研究通过含抗坏血酸钠的灭菌注射用水将产品原液稀释至11 ml，产品的乙醇含量降至9.09%。患者注射过程中，未出现明显的刺激性疼痛，显像图像未见明显血管显影。
18F-exendin-4 PET/CT显像中，患者肾及膀胱出现18F-exendin-4生理性浓聚，提示药物主要通过肾排泄，与动物实验研究结果一致[13]。与68Ga-exendin-4的PET/CT图像对比显示，2种显像剂在肾及膀胱均有浓聚，肝、脾可见轻微均匀性摄取，胰腺病变部位显像剂浓聚灶清晰，总体显像效果无明显差别[14]。患者胰腺体部见结节状18F-exendin-4高摄取，术后病理及肿瘤细胞免疫组织化学证实符合NEN(G2)特征，表明18F-exendin-4对GLP-1R具有较强的靶向性，适用于胰岛素瘤的特异性诊断。30 min及60 min的采集图像显示，病变部位SUVmax从5.9升至7.5，提示18F-exendin-4注射后60 min采集图像，病灶对显像剂的浓聚更高，更利于胰岛素瘤的诊断，但早期30 min的显像也基本满足诊断需求。由于胰岛素瘤患者易自发低血糖，禁食会加重低血糖反应，候检时应全程保持质量分数10%葡萄糖注射液滴注并定时监测血糖水平，以保障就医安全。注射前、注射后20 min及注射后50 min的指尖血糖监测结果显示，该患者的血糖波动控制在1 mmol/L以内，总体可控。先前的文献表明，由于饮食可能导致小肠分泌GLP-1，从而与68Ga-exendin-4竞争性结合GLP-1R，为保证显像质量，建议禁食后2 h再进行68Ga-exendin-4 PET/CT显像[15]。但在本研究中，患者行18F-exendin-4 PET/CT显像时未严格禁食即注射候检，胰腺病灶清晰可见且显像剂浓聚高，未见进食带来的明显影响。针对上述情况，患者使用exendin-4类似物进行显像时是否严格禁食，需纳入更多病例进一步研究，以形成技术规范。
综上所述，本研究利用All in one多功能化学合成器探索了18F-exendin-4的自动化合成，该合成方法简便、耗时少，且产率稳定，放化纯高。PET/CT显像结果表明，18F-exendin-4在胰岛素瘤的诊断中具有临床应用价值，且安全可靠，适宜在配备医用回旋加速器的医疗机构推广使用，但由于显像病例少，该显像的相关技术规范还需进一步研究拟定。
