虾肉是一种极易腐烂的产品，然而，冷藏可以减缓腐烂。本研究采用电子束辐照(EBI)红虾肉进行预处理，并利用代谢组学分析方法对处理后的虾肉在冷藏过程中的代谢产物进行分析。本研究总共鉴定出4865种代谢物，其中103种差异代谢物具有KEGG ID。此外，还获得了两个潜在的生物标志物。结果表明，在冷藏过程中，L-赖氨酸表达下调，而2’-脱氧鸟苷、5’-脱氧鸟苷和二羟丙酮磷酸酰酯表达上调。在冷藏过程中，L-赖氨酸表达降低，而2’-脱氧鸟苷-5’-单磷酸酯和二羟丙酮磷酸酯表达上调，代谢活性在9d后开始逐渐减弱。然而，本研究没有鉴定与EBI相关的不同代谢物，但研究结果还是从分子水平揭示了红虾在EBI后冷藏过程中的代谢变化。
实验结果
1. 代谢物的鉴定
UPLC-MS检测到17852个峰(包括6665个负离子峰和11887个正离子峰)。此外，本研究还鉴定出4865种代谢物，包括1861种负离子型代谢物(ESI-)和3004种正离子型代谢物(ESI+)。
2. 多变量数据分析
这项研究中最重要的步骤之一是数据质量的验证。质控样品必须反馈可靠和高质量的结果。主成分分析结果表明，所有样本基本上都在95%的置信区间内(图1)，当进行成对比较时，所有累积解释率(R2X(CUM))都高于0.6，这表明我们可以获得反映实际样本分布的主成分分析模型。主成分分析结果显示，随着冷藏时间的延长，各组之间存在明显差异。此外，随着天数的增加，第0天与其他天数的差异逐渐扩大。第12天和第15天的PCA结果比较接近，说明第12天和第15天的代谢物差异相对较小。因此，辐照后冷藏过程中的代谢组分具有明显的分布规律。此外，OPLS-DA模型显示两组之间(x轴)有显著差异，所有采样点都在95%的置信区间内。OPLS-DA模型的拟合检验表明样本的解释能力(R2Y(CUM))接近1，预测能力(Q2(CUM))大于0.55。这些结果与主成分分析的结果是一致的。200次排列检验的斜率很大，说明OPLS-DA模型没有超出拟合范围。综上所述，OPLS-DA模型具有较好的解释和预测能力并反映了不同样本组之间反应的真实差异。以上结果表明，在辐照后15d内，红虾的肌肉代谢物随时间发生显著变化。
A、B、C、D和E组分别代表0、6、9、12和15d
3. 差异代谢物的筛选和分类
本研究利用热图分析鉴定差异代谢物(图2)。热图显示，各组相交后共同上调的代谢物是2’-脱氧鸟苷-5-磷酸、八氟环丁烷和二羟丙酮磷酸酯，下调的差异代谢物是4-羟基瓜氨酸、S-蜂斗菜素、L-赖氨酸和D-吡啶甲酸。为了进一步鉴定样品随冷藏时间的变化而产生的不同代谢物，我们在OPLS-DA模型中筛选出VIP>1的代谢物。从最初鉴定的4865种代谢物中，我们总共鉴定出351种、337种、181种和145种差异代谢物。与第0天相比，第6天有134个差异代谢物上调，217个差异代谢物下调。与第6天相比，第9天只有39个差异代谢物上调，298个差异代谢物下调。与第9天相比，有110个差异代谢物上调，71个差异代谢物下调。与前两组相比，第15天和第12天差异显著的代谢物数量明显减少(54种上调，91种下调)。大多数差异代谢物是脂质和类脂分子;有机杂环化合物;核苷、核苷酸及其类似物;苯丙烷和聚酮;苯类;有机酸及其衍生物;有机含氧化合物;以及未分类的化学品。这些结果表明，红虾在冷藏过程中肌肉代谢发生了明显的变化。
A、B、C、D和E组分别代表0、6、9、12和15d
4. 差异代谢物的KEGG分类及富集分析
本研究进一步分析了不同代谢途径的富集情况。首先，我们将在四个对照组中获得的差异代谢物映射到KEGG数据库中，得到46、93、41和34个具有KEGG ID的差异代谢物。随后，我们对这些组进行KEGG途径富集分析，以确定其代谢途径的差异。有显著差异(P<0.05)的代谢途径图分别为6、8、7和2(图3)。A、B组差异代谢产物主要集中在嘌呤代谢、甘油磷脂代谢、组氨酸代谢、赖氨酸降解、氨基酰tRNA生物合成和精氨酸生物合成;B、C组差异代谢产物主要集中在组氨酸代谢、嘌呤代谢、氨基酰tRNA生物合成、精氨酸生物合成、ABC转运蛋白、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸生物合成;C组和D组差异代谢物的代谢途径主要集中在嘌呤代谢、甘油磷脂代谢、赖氨酸生物合成、ABC转运蛋白、氨基糖和核苷酸糖代谢、组氨酸代谢和肌醇磷酸代谢;D组和E组的差异代谢物只有两条途径：嘧啶代谢和嘌呤代谢。
红色和蓝色虚线分别表示 P = 0.01 和 P= 0.05;A、B、C、D 和 E 组分别代表 0、6、9、12 和 15 天。
讨论
保鲜一直是水产品研究的热点问题。新陈代谢是影响虾品质的重要因素。虾保鲜的研究主要集中在理化过程、微生物学研究、感官指标、显微结构和特殊处理后的挥发性代谢物等方面。然而，目前对LC-MS非靶向代谢组学的研究很少。本研究利用LC-MS技术对辐照后虾肌肉的代谢机制进行研究。我们通过分析KEGG，选择了以下八类来评估数据集：苯类;类脂和类脂分子;核苷、核苷酸和类似物;有机酸和衍生物;有机氮化合物;有机氧化合物;有机杂环化合物;以及苯丙烷和聚酮(表1)。苯丙烷类化合物、聚酮类化合物和有机氮化合物在这里没有被讨论，因为它们是少数几种不同的代谢物。在冷藏过程中，L-赖氨酸表达下调，而2’-脱氧鸟苷、5’-脱氧鸟苷和二羟丙酮磷酸酰酯表达上调。脂质和类脂质分子，如CDP-甘油、PC、SM，以及核苷、核苷酸和类似物，腺苷单磷酸、ADP-D-核糖、dGTP、DTMP，在前6天发生了变化。此外，KEGG ID鉴定的所有苯丙烷类和聚酮类化合物仅在前6天发生变化。KEGG ID鉴定的变化代谢物主要分布在前9d，包括大多数脂质和类脂分子、核苷、核苷酸及其类似物、有机酸及其衍生物、有机氮化合物、有机氧化合物和有机杂环化合物。9天后，差异代谢物的变化减少，其中脂质和类脂分子的变化最为明显。12天后，含有KEGG ID的有机氮化合物种类基本保持不变。以下各节将讨论不同代谢物间的生物学相关性。
1. 与苯类化合物相关的差异代谢物
差异性苯类代谢物分别属于氨基酸代谢、药物代谢和ABC转运蛋白，其中2-苯乙酰胺、3，4-二羟基苯乙酸和腺基琥珀酸是氨基酸的代谢产物。作为酪氨酸代谢的最终产物，3，4-二羟基苯乙酸在冷藏12d后显著上调，说明酪氨酸代谢在12d时达到最大值。同时，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢的中间产物腺基琥珀酸在冷藏15d后显著上调。这两种苯类物质的显著增加表明，冷藏12d后，虾的品质发生了明显的变化。
2. 与脂质和类脂分子相关的差异代谢物
脂肪氧化是肉类脂肪组织变质的主要原因，参与这些反应的主要因素包括脂质的结构类型及其环境，脂肪酸的不饱和度，以及光和热暴露。此外，分子氧、促氧化剂和抗氧化剂成分的存在也是影响脂质氧化稳定性的因素。如表1所示，保鲜过程中的脂质代谢物主要为磷脂酰胆碱(PC)，随着冷藏时间的延长，磷脂酰胆碱的含量不断减少。PC是冷藏过程中脂质代谢的潜在生物标志物，主要存在于甘油磷脂代谢中。作为质膜的一部分，PC对新细胞的生长起着至关重要的作用。因此我们预测，这一物质的下调意味着虾品质发生了变化。鞘磷脂(SM)是细胞膜和结构中普遍存在的一种成分，与细胞的生长、存活和死亡有关。此外，它还作为信号代谢产物控制免疫效应，如趋化、免疫细胞分化和效应细胞反应。综上所述，我们发现辐照后的虾在冷藏前6天内品质没有明显变化，6天后营养成分发生了变化。辐照红虾后的保鲜时间明显长于未辐照红虾。
表1 利用KEGG途径富集的差异代谢物
3. 与核苷、核苷酸和类似物相关的差异代谢物
核苷、核苷酸及其类似物主要与嘌呤代谢、嘧啶代谢、氨基糖和核苷酸代谢、甘油磷脂代谢有关。环磷酸腺苷(CAMP)是一种ATP产物，是调节细胞内物质代谢和生物功能的重要物质，是生命信息传递的“第二信使”。在嘌呤代谢中，cAMP上调表明虾肉在冷藏过程中消耗能量。作为嘧啶代谢的最终产物(图2)，DTMP在0~6d表达下调，这可能是由于生命活动减弱，导致合成减少所致。在冷藏过程中，2’-脱氧鸟苷5’-单磷酸(DGMP)含量升高，其上调机制目前尚不清楚。我们估计这是由dGTP上调引起的。根据核苷、核苷酸和类似物的变化可以看出，冷藏过程中的生命活动和能量代谢在前6d较为活跃。我们假设随着核苷、核苷酸和类似物提供的能量减少，生命活动和能量代谢变得难以维持，导致衰变加速。
4. 与有机酸及其衍生物相关的差异代谢物
有机酸及其衍生物参与许多生物途径的代谢过程。本文仅对必需氨基酸L-异亮氨酸和L-赖氨酸进行了讨论。这三种物质所代表的降解途径是缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和赖氨酸的降解。在冷藏过程中，L-异亮氨酸和L-赖氨酸的表达显著降低，说明虾肉中的营养物质流失。其他氨基酸，如L-精氨酸的下调，也证实了营养的丧失。N-2-琥珀酰谷氨酸-5-半醛是L-精氨酸和L-谷氨酸的中间产物，它的上调表明整个反应系统被加速，从而导致营养损失。有机酸及其衍生物的变化表明，虾肉在辐照后9天的冷藏过程中变化较为复杂。9天后，由于有效营养素的减少，差异代谢物的数量可能会显著减少。这也表明，与未辐照的虾肉相比，辐照后的虾肉可以显著延长其货架期。
5. 与有机氧化合物相关的差异代谢物
有机含氧化合物是一个复杂的体系，不同的化合物参与不同的途径。磷酸二羟丙酮和磷酸二羟丙酮酰酯参与甘油磷脂代谢，犬尿氨酸和L-3-羟基犬尿氨酸参与色氨酸代谢，而肌醇-1-磷酸是由葡萄糖-6-磷酸通过肌醇-1-磷酸合成酶的作用而衍生出来的(从0到6天不等)。肌醇-1-磷酸的下调表明，在冷藏过程中，磷酸和氨基酸转运蛋白的转运速度减慢，营养物质丢失。辐照9d后，有机氧化合物含量也发生了明显变化，说明辐照可以延长虾的货架期。
6. 与有机杂环化合物相关的差异代谢物
有机杂环化合物主要参与嘌呤代谢。参与该途径的主要分子包括鸟嘌呤、次黄嘌呤、海因-5-丙酸和咪唑丙酸，其中次黄嘌呤已被确定为水产品新鲜度的潜在生物标志物。鱼中的次黄嘌呤浓度随着储存时间的延长而增加，高水平的次黄嘌呤会导致苦味。然而我们发现在冷藏过程中，虾中的次黄嘌呤水平被下调。次黄嘌呤是一种与炎症和氧化应激相关的代谢标记物，它是一种可以通过提高内源性黄嘌呤氧化酶活性来改善抗菌性能的物质。它的下调可能意味着对虾细胞抗菌性能的减弱。作为ATP的分解产物，其下调可能与ATP总量的减少有关。最近的一项研究表明，次黄嘌呤可以通过UCP2诱导肌肉ATP的消耗。
结论
在本研究中，我们研究了辐照红虾在冷藏过程中的代谢变化。在15天的冷藏期间，我们鉴定了4865种代谢物，其中103种具有独特的KEGGID。差异性代谢物的主要KEGG富集途径为嘌呤代谢、甘油磷脂代谢和组氨酸代谢(P<0.05)。我们在冷藏过程中发现了两个潜在的生物标志物，即PC和次黄嘌呤。磷脂酰胆碱是脂质代谢的生物标志物，次黄嘌呤是水产品新鲜度的生物标志物。脂质和类脂分子、核苷、核苷酸、类似物和有机酸及其衍生物在虾肉冷藏过程中起着重要的作用。本研究从分子角度论证了辐照可以延长虾肉的货架期，，从而为辐照鲜虾提供了理论依据。
原文链接： https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0308814621017192
