据估计，每年有数以万计被诊断为癌症的女孩和年轻成年妇女面临着与治疗有关的对她们未来生育、激素生产、心理和性健康的威胁。目前，由于诊断和治疗的进步，许多儿童和青年癌症的高长期存活率是可以实现的;然而，很多类型肿瘤与长期的生殖和内分泌影响有关。这些肿瘤，包括肉瘤、室管膜瘤、副神经节瘤、神经鞘瘤、软骨肉瘤和脊索瘤，通常需要对卵巢附近的靶点进行放射治疗。因此，迫切需要新的放射治疗策略来预防对患有盆腔肿瘤的妇女进行放疗所带来的卵巢损害。
近年来，调强放射治疗(IMRT)等先进技术被越来越多地用于减少对周围健康组织的高剂量照射;然而，这导致低剂量和中剂量的辐射被传送到更大的区域。因此，即使使用最先进的光子治疗方式，卵巢损伤很大程度上也是不可避免的。由于质子束独特的物理学优势，此前已经有人提出使用质子治疗来预防卵巢损伤，但质子治疗在卵巢功能或卵巢储备方面的安全性从未在人类或动物研究中直接进行过测试。因此，对于质子SOBP远端生物有效性的提高或产生的次级中子是否会对敏感卵巢组织造成意外的损伤，存在很大的不确定性。
日前，来自西北大学范伯格医学院放射肿瘤科的研究人员以雌性小鼠为研究对象，对小鼠在分别接受γ射线放射治疗(GRT)和质子放射治疗(PRT)后其AMH(anti-Mullerian hormone)及原始卵泡数量进行了比较，并探讨了质子放射治疗保留卵巢功能和保护卵巢储备能力的可行性和有效性。原文发表于红皮杂志《International Journal of Radiation Oncology · Biology · Physics》。
材料和方法
动物定位及照射条件
研究人员将雌性青春期前CD-1小鼠(出生后21天，n=124)分为：1)对照组(n=30);2)单次剂量1.8 Gy GRT(n=13);3)单次剂量1.8 Gy PRT，卵巢定位在扩展布拉格峰(SOBP)坪区中心(n=13，见图1A);4)单次剂量1.8 Gy PRT，卵巢定位在SOBP坪区以外(n=29，见图1C);5)单次剂量0.2 Gy GRT(n=14);6)单次剂量0.2 Gy PRT，卵巢定位在SOBP坪区中心(n=13，见图1A);7)单次剂量0.2 Gy PRT，卵巢定位在SOBP远端下降区(n=12，见图1B)。图1描述了质子治疗中动物卵巢位于SOBP的位置。
研究人员使用标定后的笔形束扫描质子束对小鼠进行了PRT实验。麻醉后(三溴乙醇250 mg/kg，腹腔注射)，小鼠被放置在一个由水等效蜡制成的定制平台中。该平台还包含3个平行板电离室，分别位于相对于平台顶部1、5和20毫米水等效深度处。室内激光被用来将动物的骨盆定位于质子束中心轴上。小鼠采用俯卧位，布置射野从下方照射小鼠。在所有PRT实验中，处方剂量使用恒定的RBE值1.1。
小鼠GRT实验采用铯-137γ辐照装置进行。麻醉后，小鼠被放置在定制的以铅为基础的合金屏蔽室中，在屏蔽室的两侧开一个直径为5厘米的圆形切口，让光束穿透动物的骨盆，同时阻挡射线穿过身体的其他部分。特别是下丘脑-垂体区域，以排除由于关闭下丘脑-垂体-性腺的反馈系统而导致卵巢功能停止的可能性。在每只小鼠的头部、侧面和腹部放置热释光量计，在照射后确定其接受的物理剂量。
AMH评价治疗后卵巢功能
通过测量AMH来评估卵巢功能随时间的变化。在基线和治疗后1周、3周、8周，对动物进行称重并采用下颌刺针穿刺来获得干血点(DBS)。在试验卡上采集DBS，并存储在零下80度条件下，然后送去处理(An实验室)。样品批间和批内变异系数分别为1.8%和3.0%，AMH的检出下限为0.012 ng/mL。
用存活的卵巢原始卵泡计数评估治疗后卵巢储备
通过计算治疗后8周的原始卵泡总数来评估卵巢储备。最后一次采集DBS后，采集卵巢并使用改良的戴维森固定液在4度条件下将其固定24小时，石蜡块包埋，并以5微米厚进行连续切片。每组4只动物(8只卵巢)用苏木精和伊红染色，每隔5个切片计数卵泡。采用数字成像系统采集显微图像，并使用ImageJ Version 1.45s进行成像分析和卵泡计数。
体外全卵巢照射，验证质子和光子照射对卵巢原始卵泡储备的影响
为了验证PRT在相对于SOBP精确测量的深度对原始卵泡的影响，研究人员进行了一个单独的实验。采集自出生后5天的雌性小鼠(n=56)的卵巢，在12孔板中加入生长介质、原蛋白和ITS，置于便携式培养箱中，温度为37℃，二氧化碳浓度为2%。离体小鼠卵巢被放置在一个定制的水等效蜡模中。卵巢组分别被放置在SOBP坪区的中心，远端SOBP区域外5 cm，远端SOBP区域外0.5 cm，及远端SOBP区域外1 cm。
统计分析
所有的统计分析和绘图使用R 3.5.3版本。采用方差分析(ANOVA)对数值变量和类别变量进行组间比较。由于在整个研究过程中对单个动物反复测量了AMH，因此使用随机多变量线性混合效应回归来评估放射治疗方式、剂量和每个时间点AMH变化之间的关系。考虑到基线卵巢储备和AMH水平的预期差异，以及动物间不同放射敏感性的潜在差异，这些被认为是随机效应。固定效应会考虑放疗剂量、动物体重、是否对动物进行CT、AMH测量时间(基线、1周、3周、8周)。同时检测AMH测量时间与剂量组间的相互作用。对于所有的测量，P<0.05被认为具有统计学意义。
研究结果
卵巢功能和原始卵泡储备功能只有在卵巢处在SOBP以外时才能通过质子治疗得以保存
为了验证传输的剂量以及它们对卵巢原始卵泡死亡的影响，研究人员采用GRT或PRT治疗方式对动物进行了试验。当动物被定位好后，使用放置在动物背部和腹部表面的热释光剂量计来测量剂量。此外，治疗后会进行CT扫描。在治疗后的第1、3和8周，通过AMH的变化来评估卵巢功能。考虑到动物体重，在卵巢处于SOBP坪区外时，AMH与对照组相当(P=0.5)，表明卵巢功能得以保留。然而，在传输1.8 Gy的GRT治疗(β=-4.9 ng/mL;P<0.001)或卵巢处于SOBP坪区中心的PRT治疗(β=-5.1 ng/mL;P<0.001)中AMH值大幅度下降，提示卵巢功能衰竭已经发生。
对于卵巢位于SOBP坪区中心接受0.2 Gy剂量照射的动物，无论是GRT还是PRT治疗，均显示卵巢功能下降。在治疗后8周，AMH值显著低于对照组，这是由于产生AMH的生长滤泡的增殖颗粒细胞受到损伤的原因。这一结果说明了即使是在小剂量照射后，AMH在检测长期卵巢损伤时仍具有一定的敏感性。
纵向测量AMH可预测放疗后卵巢储备功能
为了评估AMH是否能够作为卵巢剩余储备功能的替代标志物，在GRT放疗后1、3和8周对AMH进行了纵向测量，并与动物体重和各类卵泡数量进行了比较。结果显示原始卵泡总数与AMH显著相关。AMH与初级卵泡、次级卵泡及囊状卵泡也同样被观察到具有显著相关性。
卵巢位于远端SOBP时，质子治疗后AMH水平保持不变，但原始卵泡储备减少
当卵巢位于SOBP远端经过0.2 Gy PRT照射后，与对照组相比，治疗后8周的AMH值无显著差异，这表明卵泡颗粒细胞未见明显损伤。然而，尽管AMH值正常，但在治疗8周后，这些卵巢的原始卵泡总数显著降低(平均每只动物原始卵泡410.2个，相对于675.5个;P=0.005)。与对照组相比，如预期的一样，产生AMH的卵泡被保存了下来。
体外卵巢照射证实了质子照射对体内观察到的原始卵泡储备功能的影响
与对照组相比，位于SOBP之外的卵巢没有显示出显著的原始卵泡丢失;位于SOBP远端的卵巢有显著的原始卵泡丢失;位于SOBP坪区中心的卵巢有显著的原始卵泡丢失。
讨论
鉴于许多罹患癌症的年轻妇女的存活率大大提高，人们也越来越重视生活质量，特别是生育和内分泌功能。PRT可在支持改善生殖结果方面发挥重要作用，可以增强需要对盆腔区域进行放射治疗的妇女的生育能力。此外，儿童时期对子宫的照射会导致不可逆转的纤维化，进而导致成年后子宫体积的减小。这种并发症与未来的死胎和新生儿死亡有关。如本研究所示结果，如果子宫接受PRT治疗并置于质子SOBP之外，这种并发症也可能会被避免。
此外，需要注意的是，小鼠模型可能不适用于人类。事实上，XRT/GRT照射在小鼠卵巢中的一些剂量反应关系可能与人类不同。此外，束流品质在不同的摆位条件下会有显著的差异，仅指定SOBP的使用并不能充分说明束流品质，特别是在远端边缘或布拉格峰以外。在本动物研究中，没有直接评估束流品质的影响。研究人员表明需要开展进一步的工作，这包括为了评估从小鼠剂量反应结论外推到人类的准确方法而需要直接测量卵巢附近的束流品质。关于小鼠卵巢剂量敏感性的结论可能并不能直接适用于人类。然而，通过比较这些研究中的PRT和XRT/GRT照射，可以得出这些不同照射方式对小鼠卵巢功能影响的相关结论，并假设这些相对差异在人类中保持不变。
研究结论
AMH水平和原始卵泡总数是卵巢组织学和功能的敏感指标。研究人员表明，利用这些标记物，可以通过使用体外和体内小鼠模型，来评估XRT/GRT照射卵巢、PRT照射SOBP坪区中心区域的卵巢及PRT照射SOBP远端区域的卵巢的辐射损伤效应。在该项研究中，研究人员证实了PRT照射位于SOBP以外的卵巢仍可以使小鼠保持卵巢储备功能，这也证明了质子治疗在保留生育功能方面的安全性，并提议质子放射治疗可以作为一种可行的生育保留放疗策略。
